第二节 单克隆抗体研究中实验动物的选择与应用
一、单克隆抗体技术与实验动物关系
杂交瘤（Hybidoma）合成单克隆抗体（Monoclonal Antibodies,McAb）是近年来生物医学中的一项重大突破。从根本上解决了免疫学中长期存在的“特异性”和“重复性”问题，在短短的几年里，在许多不同科学领域内发挥了巨大作用。
单克隆抗体技术是在1975年由Kohler和Milstein首创的，他们在60年代发展起来的细胞杂交技术的基础上，成功地把两种细胞融合在一起，一种是已适应体外培养的小鼠骨髓瘤细胞（都来自BALB/C品系的小鼠）和一种经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成杂交细胞，发现这种融合的杂交细胞兼有两个亲代细胞的特征，即既有骨髓瘤细胞无限生长的能力，又有浆细胞合成单一抗体的能力。因此，这种免疫细胞通过克隆化，成为单克隆系（单一纯化的无性繁殖细胞系），就能产生大量单一类型的高纯度抗体，这种抗体就叫作“单克隆抗体”，如果把杂交细胞再种入动物体内，可形成“杂交细胞瘤”，瘤子产生大量抗体，就可以从动物体液中抽出含有单克隆抗体的体液，把这种杂交细胞在体外培养，培养液中就有大量的单克隆抗体，可供实验研究和临床研究使用。
目前，杂交瘤单克隆护体的应用范围愈来愈广泛，已经深入到整个生物医学的各个领域，诸如生物化学、分子生物学、免疫学、药理学、病毒学、细菌学、寄生虫学、肿瘤学、遗传学、药物学、血液病学、内分泌学等等。几乎所有抗原物质都可以应用这项技术获得针对单一抗原决定簇单克隆抗体。所以，可以说它是一把分子刀，用它可以剖析任何一种抗原物质的细微结构；它又是一种均质的、高特异性的抗体，可用它研究免疫学、遗传学、肿瘤学和其他学科中各种复杂的现象，同时还可用于诊断各种疾病，包括恶性肿瘤；它又可当作一种药剂治疗某些疾病，甚至肿瘤；还可以用于提纯各种蛋白质。
实验动物在杂交瘤单克隆抗体技术中占有极为重要的作用。它是形成单克隆抗体的必须条件。正如Milstein指出：如果在理论上没有克隆选择学说，在技术上没有细胞融合（Cell Fusion）和培养方法，在材料上没有实验性骨髓瘤和体外培养的髓瘤细胞，就不可能出现单克隆抗体。这充分说明了实验动物和骨髓瘤细胞系在杂交瘤技术中的重要作用。
二、常用于淋巴细胞杂交瘤技术的实验动物
（一）小鼠BALB/C系
它是此技术中最常用的动物。目前用于细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞几乎都来源于BALB/C系小鼠。其杂交瘤可接种于BALB/C或它的杂交第1代小鼠，从带瘤动物取血清或腹水制备单克隆抗体。
BALB/C系小鼠起源于Bagg从1913年开始维持的白化株（Albine stock）小鼠，Dowell从1923年开始作近交系培育，至1932年达26代，之后Snell将BALB加C即BALB/C，以前的近交历史不清，继之以Andervont为主，使BALB/C广泛传播和应用。1973年美国NIH增培育到近交157代。毛色基因为AA、bb、cc(白色)。H-2为d型。亚系有：BALB/cCd,BALB/cJ,BALB/cAnN等。该品系小鼠的主要特性：
1．免疫学特性：易患慢性肺炎。多数个体于6月龄以后出现免疫球蛋白过多症。主要是IgG1和IgA量的增加。免疫球蛋白的绝对量依饲养条件而异。腹腔注射矿物油后可引起浆细胞瘤。发生率0-60%，依亚系及饲养条件而异。较难诱发免疫耐受性。
2．生理学特性：血压较高。网状内皮系统器官与体重之比较大。大部分雄鼠在20日龄出现脾脏淀粉样性变。对放射线极度敏感。
3．癌发生率：乳腺癌发生率低（3%），但对致癌因子敏感。肾上腺和肺常发生，雌鼠的肺癌发生率为21%，网状细胞瘤为8%，血管瘤为6%，淋巴肉瘤为4.5%。
4．老化及寿命：老龄鼠出现心脏病和多发性动脉硬化症。平均寿命雄鼠为569～648天，雌鼠561～816天。252日龄平均体重为雄鼠30克雌鼠28克。
5．对细菌及病毒反应：该品系小鼠对鼠伤寒沙门氏菌C′5敏感，对麻疹病毒中度敏感。
6．饲养注意点：生育年龄长（至12月龄），容易饲养繁殖，最适稍高温度。为26-27℃因为体型较细，除了日常饲料外，每日早晚每只各喂1克白面包，每星期喂二次木鱼（日本传统加工食品），稍肥后较易繁殖，根据我们的饲养经验每周加三次煮熟的鸡蛋，效果很为满意。该品系小鼠易患肺炎，最好不要和其它近交系小鼠同室饲养，不使其它近交系小鼠发病的环境病原菌易使BALB/C鼠患鼠。
（二）大鼠LOU（又称LOU/Wsl）系
该品系可能来自Wistar大鼠，是1956年开始近亲交配而形成的品系。约在一岁龄时，大鼠回盲部淋巴结产生一种自发性肿瘤，发展迅速，当触及肿瘤后的一个月内死亡。此种肿瘤的发生率超过10%，形态为极低分化为淋巴细胞，称之为大鼠回盲部免疫细胞瘤（Rat Ileocecal Immunoocytoma），此种肿瘤移植于同系大鼠或其杂交第1代均易发生。
此种肿瘤约有60%病例合成单克隆性IgG或IgA，或K型Bence-Jones蛋白。未发现产生IgM。大鼠Y3-Ag1.2.3骨髓瘤细胞系是LOU系大鼠骨髓瘤体外培养所慕名而获，故LOU系大鼠也适用于B细胞杂交瘤技术。
LOU/C大鼠8月龄以上的雄鼠自发性浆细胞瘤发生率为30%，而雌鼠为16%，常发生在回肠淋巴结，其中60%的这种浆细胞瘤合成单克隆免疫球蛋白IgG1(35%)、IgE(36%)或IgA。LOU/C与LOU/M的组织相溶性相同，可以互相接种进行皮肤移植。
双特异性单克隆抗体（BSMCA）的研究，是项国剑桥大学分子生物学实验室Milstein博士（单克隆抗体技术创始人之一）正在进行的研究，国际上刚开始，制备双特异性单克隆抗体就必须要使用LOU大鼠。同时，用LOU大鼠制备单克隆抗体其腹水产量比用BALB/C小鼠大几十倍，能较好地解决单克隆抗体的大量制备。双特异性单克隆抗体技术和杂交～杂瘤技术是单克隆抗体技术的新进展，BSMCA可代替交联剂，代替酶标技术，在免疫组化和免疫测定技术有广泛的应用价值，在癌症的导向治疗和体外免疫扫描诊断上有广阔的应用前景。
三、实验动物的自发性和诱发性骨髓瘤
（一）自发性骨髓瘤
根据报导能合成免疫球蛋白的肿瘤存在于狗、马、地鼠、大鼠和小鼠。除大鼠、小鼠外，这类肿瘤在其它动物仅偶然发现，故未能广泛用于研究。在小鼠中，与Ig产生相关联的肿瘤包括浆细胞瘤（骨髓瘤）和淋巴瘤。这些肿瘤能分泌Ig或有Ig结合在在细胞表面，或分泌与表面结合同时存在。至今研究最广泛的、能产生Ig的小鼠肿瘤为浆细胞瘤。其来源为单克隆性，几乎每一种浆细胞瘤细胞都只产生一种Ig分子，含有相同的轻链和重链。小鼠自发性浆细胞瘤最常发生于回盲部粘膜固有层，伴有粘膜溃疡和粘膜下炎症。晚期肿瘤转移至肠系膜淋巴结。Pilgrim系统研究了125例小鼠回盲部浆细胞瘤，诊断依据是在回首部有形态异常的浆细胞。此种肿瘤一般难以移植成功。据报导，已建成的移植性瘤株有：产生IgG的×5563，产生IgA的×5647、SPCI和DPCI（均来源于C3H/He小鼠）及YPCI（来源于BALB/CXA的F1杂交小鼠）。
（二）诱发性骨髓瘤
1959年Mervin首先报导BALB/C小鼠诱发性浆细胞瘤是将装有C3H小鼠乳腺癌组织的微孔扩散盒植入小鼠腹腔，6个月后在腹膜下结蹄组织的发生浆细胞瘤或纤维肉瘤并有出血性腹水。后来发现，BALB/C小鼠腹腔注入Freund 佐剂可诱发浆细胞瘤，只注射矿物油也可诱发浆细胞瘤。1962年Potter报导，小鼠腹腔注入矿物油0.5毫升，两个月1次，共3次，40～60%雌鼠可诱发浆细胞瘤。其诱发可能与多种因素有关，最重要的是遗传因素。BALB/C小鼠有独特的敏感性，浆细胞瘤诱发率很高，其它纯系小鼠如DBA/2、A/He、A/LN、C57BL/He、C57BL/Ka、C3H/He等，注射矿物油或植入扩散盒仅偶见诱发浆细胞瘤。NZB小鼠可能和BALB/C系小鼠一样敏感，但由于动物死于其它原因，诱发率通常较低。BALB/C与其它品系小鼠杂交的第1代，注射矿物油的诱发率一般很低，但例外的是（BALB/C×NZB）F1的诱发率高达60%。另一有关因素是激素，BALB/C小鼠注射矿物油时，雄性鼠诱发率比雌鼠高。雌鼠注射睾丸酮可提高诱发率，注射孕酮、雌二醇、皮质醇则可抑制浆细胞瘤发生。注射纯的链烷化合物Pristane（2，6，10，14-四甲基十五烷）可以在BALB/C小鼠诱发浆细胞瘤。1983年Potter报导，浆细胞瘤的诱发率大致和注射Pristane的量成正比，注射总量为1.5毫升（分三次注射，每次0.5毫升）的诱发率为61%；剂时1毫升（一次注射）的诱发率为42%，1毫升分两次注射的诱发率为39%；一次注射0.5毫升的诱发率仅为22%。鼠龄对诱发率也有影响，比较2个月、8个月和1年龄的动物，其诱发率以1年鼠龄动物最低。
四、用于融合的动物骨髓细胞系
淋巴细胞杂交瘤（Lymphocytic Hybridoma）技术需要骨髓细胞系（Myeloma Cell Line）。在淋巴细胞融合技术中，理想的骨髓瘤细胞系应能获得高融合率，并得到产生特异性抗体的杂交瘤。有些骨髓瘤细胞系不仅融合率不高，而且本身分泌免疫球蛋白（Ig），致使杂交瘤细胞仍分泌亲系骨髓瘤的Ig链。据估计，细胞融合时，在两种重链和两种轻链随机组合的情况下，得到的杂交瘤可能产生10种Ig分子，特异性抗体只占其总量的1/16。为了得到只分泌特异性抗体的杂交瘤，需选择本身不产生Ig的骨髓瘤细胞系。其次，适用的骨髓瘤细胞系应对8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine,8-AG）或6-硫鸟嘌呤（6-thioguanine,6-TG）有抗药性，缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthineguanine Phosporibosyl Transferase,HGPRT），不能利用外源性次黄嘌呤（H），在含HAT（次黄嘌呤Aypoxanthine，氨基蝶呤Aminopterin，胸腺嘧啶核苷Thymidine）的培育液中死亡。
现已建立的用于B细胞杂交瘤技术的小鼠和大鼠的骨髓细胞系有下列几种
1．小鼠P3-NS1/1-Ag4-1(1976年kohler)。是常用的骨髓瘤细胞系，来源NS1/1是小鼠骨髓瘤P3（MOPC21）细胞系的亚系，P3细胞分泌IgG1(K)。NS1/1细胞不合成重链（rl），只合成而不分泌轻链（K）.P3-NS1/1-Ag4-1是NS1/1的亚系，抗8-Ag(20μg/ml)，在HAT培养液中死亡。
2．小鼠P3-X63-Ag8。是Kohler和Milstein首次获得产生McAb杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系。来源：它来自BALB/c小鼠的P3（MOPC21）骨髓瘤细胞系，分泌IgG1(K),抗8-AG（20μg/ml），在HAT培养液中不生长。
3．小鼠P3-X63-Ag8.653(1979年Kearney)。是P3-X63-Ag8的亚克隆，不可逆地丧失表达免疫球蛋白rl重链和K轻链的能力，其生长特性、融合率及所产生的杂交瘤细胞系的稳定性等方面均可与PS-X63-Ag8或P3-NS1/1-Ag4-1相比拟。
4．小鼠P3-X63-Ag8-U1（1980年Sharon）。是P3-X63-Ag8骨髓瘤细胞系的变系。P3-X63-Ag8分泌重链（rl）和轻链（K），P3-NS1/1-Ag4-1则只合成而不分泌轻链（K）。
5．小鼠SP2/O-Ag14（1978年Shulman）。Kohler等将PS-X63-Ag8骨髓瘤细胞系与具有抗绵羊红细胞活性、产生r2b重链和K轻链的BALB/c小鼠脾细胞融合得到杂交瘤细胞系Sp2/HLGK，从后者得到的Sp2/HL-Ag进行再克隆，得到Sp2-Ag14。它抗8-AG，在HAT培养液中死亡，不分泌Ig链，其细胞含有约73个染色体，比P3-X63-Ag8骨髓瘤细胞系多8个染色体，用其融合得到的杂交瘤数与P3-X63-Ag8相似。
6．小鼠45.6TG1.7（1976年Margulies ）。来源于小鼠MPC-11骨髓瘤，分泌重链（r2b）和轻链（k），抗6-TG（5μg/ml）,在HAT培养液中死亡。
7．小鼠45.6TG1.7.5(1980年Sharon)。是45.6TG1.7骨髓瘤细胞系的亚系。
8．小鼠PuBul-Ou(1976年Kohler)。是分泌IgG2a（k）的骨髓瘤细胞系，对哇巴因（Ouabain）抗药。
在细胞融合技术中，使用大鼠骨髓瘤细胞系的优点是，从带瘤大鼠得到的血清和腹水量约比小鼠高10倍，适于大量生产McAb或同种异型的抗大鼠抗体。
1．大鼠Y3-Ag1.2.3（1979年Galfre）。Lou系大鼠的骨髓瘤经体外培养获得的细胞系R210，从它得到抗8-AG的亚系210·RCr3.Agl（分泌k轻链），后者经两次克隆，选获Y3-Ag1.2.3。它经5个月连续培养后，与脾细胞的融合率可达到小鼠髓瘤细胞系的水平。在显微镜下，Y3-Ag1.2.3系及其杂交瘤细胞比小鼠P3-X63-Ag8骨髓瘤细胞要小的多。它在OMM培养液（含5%胎牛血清）生长良好，在软琼脂易产生克隆。Y3-Ag1.2.3及其杂交瘤所产生的克隆，细胞分布较分散，不象小鼠×小鼠杂交瘤的克隆细胞密集。用它与DA系大鼠脾细胞融合，获得抗小鼠IgG的大鼠McAb。其杂交瘤YAZ/4OH（LK）细胞接种在（LOU×DA）F1大鼠可以产生肿瘤，带瘤大鼠血清中抗体含量为10～15mg/ml。因此认为210.RCY3-Ag1.2.3是适用于大鼠×大鼠细胞融合的骨髓瘤细胞系。
2．大鼠YB2/o（1982和Kilmaruin）。此细胞系不分泌k轻链。将YB2/o及Y3-Ag1.2.3分别与经酵母微管蛋白免疫的大鼠脾细胞融合，结果证明两者均适用作细胞融合的亲系，而且YB2/O产生的杂交瘤不分泌骨髓瘤的抗体链。接种杂交瘤的大鼠血清滴度可达1：106。