骨关节炎在中医学中属于 “痹证” “痿证” 等范畴， 该病最 早记载于《黄帝内经》 。 《黄帝内经》认为本病的病机是肝肾亏 虚、 长期劳损及外感风寒湿邪所致。 《素问·痹证》记载： “风 寒湿三气杂至， 合而为痹也” ； 《素问·刺节论》记载： “病在骨， 骨重不可举， 骨髓酸痛， 寒气至， 名曰骨痹” ； 《素问·脉要精微 论》记载： “膝者， 筋之府， 屈伸不能， 行则偻附， 筋将惫矣” 。 此 外， 《素问· 上古天真论》还认为人的生长、 衰老与肾气的盛衰 有密切联系。 后世医家在《黄帝内经》 “肾主骨、 肝主筋” 的理 论指导下 ， 经过不断的认识及临床实践， 归纳本病病机为 “肝肾 亏虚为本， 气滞、 血瘀、 痰湿凝聚为标” ， 通过运用上述中药来 对症治疗骨关节炎， 创制了不少行之有效的方剂， 龟鹿二仙胶 便是在这一理论指导下创制的。
龟鹿二仙胶的性味及功用
龟鹿二仙胶最早见于《医便》 ， 其原文云： “延龄育子， 龟 鹿二仙胶： 此方试治极效， 专治男妇真元虚损， 久不孕育； 并治 男子酒色过度， 销砾真阴； 妇人七情伤损血气； 诸虚百损， 五劳 七伤， 并皆治之” 。 本方由龟板胶、 鹿角胶、 人参、 枸杞组成， 具 有补益肝肾、 填精益髓、 助阳益气的作用。 方中君药龟板胶、 鹿 角胶均为血肉有情之品， 能大补阴阳精血。 龟板胶， 味甘咸， 性 寒， 归肝、 肾、 心经， 具有滋阴潜阳、 益肾健骨、 养血补心之功效， 《本草纲目》记载： “治腰脚痠痛， 补心肾” ； 鹿角胶， 味咸、 性 温， 归肝、 肾经， 具有补肾助阳、 强壮筋骨、 活血散瘀消肿的效 果， 《本草纲目》记载： “生精补髓， 养血助阳， 强筋健骨， 治一 切虚损” 。 二药合用， 一阴一阳， 互根互用， 从而达到了大补肾之 阴阳、 强壮筋骨的作用。 鹿角胶性温， 龟板胶性寒， 两者配伍， 补阳而不燥， 滋阴而不腻。 臣药人参大补元气， 与鹿角胶合用能 补气助阳； 与龟板胶合用能益气生津。 枸杞味甘、 性平， 归肝、 肾 经， 可补肝肾之阴， 四药合用， 加强了补肝肾之力。 临床研究 [1] 表 明， 龟鹿二仙胶方治疗骨关节炎效果肯定， 将本方应用于骨关节 炎的治疗， 正是针对骨关节炎患者肝肾亏虚的病机而言的。
龟鹿二仙胶不同提取部位对软骨细胞活性的影响
1. 结果分析 相关研究结果显示 [2] ： 3种不同提取部位的含 药血清， 都能显著地促进豚鼠关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原、 增 加蛋白黏多糖分泌， 上调Bcl-2基因表达， 减少MMP-3的表达， 而 其作用程度都按醇提组、 水提组、 烷提组的顺序依次递减。 该 结果表明： 龟鹿二仙胶3种提取部位都可通过增加软骨细胞外 基质Ⅱ型胶原及蛋白黏多糖的表达， 从而稳定软骨细胞表型； 通过增加Bcl-2基因表达， 从而抑制软骨细胞凋亡； 通过抑制 MMP-3表达， 延缓软骨细胞外基质的降解和破坏。 龟鹿二仙胶 通过以上途径来抑制关节软骨细胞的凋亡、 降低关节软骨组织 及细胞外基质破坏， 提高软骨细胞活性， 从而延缓骨关节炎进 程， 其中醇提组该效果最显著， 水提组次之。
2. 作用机制 龟鹿二仙胶醇提取部位主要含有甾体类生 物激素及其化合物、 皂苷以及黄酮类等物质； 其水提取部位主 要包含多糖类及氨基酸、 蛋白质、 维生素、 无机盐等化学物质； 其烷提取部位主要含有脂肪酸、 脂肪酸酯、 生物碱及部分亲脂 性的甾体类物质。 研究表明： 龟甲胶能调节机体功能， 激发机 体自身调节机制， 增强自身稳定状态 [3] ； 龟甲胶可以纠正甲亢阴 虚动物模型全身各系统的病理、 生理变化 [4-5] 。 鹿角胶可防治 骨质疏松症， 增加骨密度、 骨矿物质含量； 有保护胃黏膜， 补血 壮阳， 抗衰老， 抗疲劳， 增强机体免疫力等作用 [6-7] 。 人参皂苷 可以明显地提高骨关节炎患者关节软骨细胞中Ⅱ型胶原基因的 表达 [8] ； 人参皂苷可明显地降低成纤维细胞中基质金属蛋白酶 MMP-1和MMP-3的分泌 [9] ； 人参皂苷Rb1 [10] 、 Rg1 [11] 可分别提高大 鼠脑神经元及兔晶状体上皮细胞中Bc1-2基因的表达， 抑制有 关细胞凋亡； 还有研究显示： 枸杞多糖可降低大鼠腰椎间盘中 的MMP-3表达 [12] ； 具有增加小鼠肝细胞中Bcl-2表达的作用 [13] ， 而枸杞水煎剂可明显提高大鼠的肾脏组织中Bcl-2的表达 [14] 。 以 上研究证实： 人参皂苷有干预Ⅱ型胶原、 MMP-3、 Bcl-2三者基 因表达的作用， 而枸杞多糖有干预MMP-3、 Bcl-2二者基因表达 的作用， 因此支持龟鹿二仙胶3种不同提取部位可有效干预以 上4个指标的表达， 其醇提取部位最有可能是其发挥药效的有 效部位。
龟鹿二仙胶及其拆方的相关研究
1. 龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对关节软骨细胞增殖的 作用 李楠等 [15] 研究发现： 龟鹿二仙胶及其拆方对SD大鼠和 豚鼠软骨细胞均有促增殖作用， 其中SD大鼠软骨细胞增殖变化 率较高。 有研究 [16] 通过MTT法检测龟鹿二仙胶全方与其各拆 方对软骨细胞增殖的比较， 显示： 龟鹿二仙胶全方可显著地促 进软骨细胞增殖， 药效显著优于各拆方。 通过各拆方之间的比 较， 可以发现龟板胶或鹿角胶促进软骨细胞增殖的作用显著优 于人参或枸杞； 鹿角胶对软骨细胞的促增殖作用无明显优于龟板胶； 人参和枸杞对软骨细胞无明显促增殖作用； 证实了君药 龟板胶与鹿角胶在全方发挥促软骨细胞增殖作用中占据主导地 位， 臣药人参和佐药作为拆方， 虽然无明显促进软骨细胞增殖 的作用， 但通过与龟板胶、 鹿角胶配伍后， 可协同君药共同发 挥出更加显著的药效， 提示人参、 枸杞具有显著的协同辅助作 用， 从而初步揭示了龟鹿二仙胶的配伍规律， 为我们今后临床 遣方用药， 优化配伍提供了新思路。 此外， 临床用药也可以选择 性地增加配伍益气类（如黄芪、 党参）与滋阴中药（如熟地黄、 女贞子） ， 来探究其相应药效学的变化情况。
2. 龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对关节软骨细胞合成Ⅱ型 胶原的影响 杜江等 [17-18] 研究发现： 龟鹿二仙胶全方能显著促 进软骨细胞Ⅱ型胶原的表达， 其促增殖作用优于各拆方组。 研 究 [16] 显示： 龟鹿二仙胶促进Ⅱ型胶原合成的能力不及适宜剂量 的阳性对照组， 但全方药效显著优于各拆方。 龟板胶和鹿角胶 都能显著地促进Ⅱ型胶原合成， 鹿角胶促进Ⅱ型胶原的合成能 力无明显优于龟板胶， 人参和枸杞都无明显促进Ⅱ型胶原合成 的作用， 证实了君药龟板胶和鹿角胶在全方促Ⅱ型胶原合成药 效中发挥了主导作用， 二者药效相当； 臣药人参与佐药枸杞虽 然不能有效地促进软骨细胞Ⅱ型胶原的合成， 但可以协助君药 共同发挥出更明显的药理学效应。
3. 龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞蛋白黏多糖 合成的影响 有研究 [15] 显示： 通过全方与拆方之间的对比， 发 现全方在提高蛋白黏多糖表达方面显著优于各拆方。 君药龟板 胶和鹿角胶虽然都能显著地提高蛋白黏多糖的表达， 但药效不 及全方。 各拆方之间比较， 鹿角胶与龟板胶促蛋白黏多糖合成 的药效相当， 臣药人参和佐药枸杞对蛋白黏多糖的表达无明显 促进作用。 表明君药促蛋白黏多糖合成药效在全方中占据主导 作用， 而人参和枸杞具有明显的协同辅助作用。
4. 龟鹿二仙胶及其拆方含药血清对软骨细胞凋亡的影响 4.1 Bcl-2和Bax基因表达在骨关节炎中的意义 抑凋基因 Bcl-2家族和促凋基因Bax具有同源性， 它们共有两个相同的结 构域BH1和BH2。 Bcl-2基因是从小鼠B淋巴细胞瘤中发现的， 因 其具有抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的功能而被认为是凋亡 抑制基因。 Bcl-2通过抑制凋亡蛋白酶激活因子（APAF-1） 而抑 制凋亡的发生 [19] 。 Bcl-2在线粒体上可直接调节膜上通透性转换 孔来调节线粒体膜的通透性， 以阻止细胞色素C释放入胞质而 抑制细胞凋亡； 而Bax可直接结合到线粒体膜上， 改变膜的通透 性， 引起细胞色素C释放入胞浆， 激活Caspase家族， 最终引起 凋亡 [20-21] 。 此外， Bcl-2编码的产物 Bcl-2蛋白可通过拮抗野生型 P53蛋白的促凋亡作用， 将c-myc蛋白由促凋亡作用逆转为抑制 凋亡作用， 稳定线粒体的结构和功能， 阻断Capspase酶类活化的 上游信号传递通路等作用， 抑制多种因素诱发的细胞凋亡 [22] 。 有研究 [23] 表明， 在动物局灶性缺血和全脑缺血过程中， 此 两种基因被相应的激活和抑制， 改变了神经细胞内Bax和Bcl-2 蛋白的表达， 使Bax蛋白表达升高而Bcl-2蛋白表达降低， 两者 之间的平衡关系被破坏。 MacGibbon G等 [24] 用动物脑缺血缺氧 卒中模型发现， 在海马区、 皮质、 小脑、 纹状体的神经元细胞核 中 Bax呈高水平的表达。
软骨细胞凋亡也是受凋亡基因调控的。 Bcl-2具有抑制软 骨细胞凋亡的作用， Bax与Bcl-2的作用相反， 具有诱导软骨细 胞凋亡的作用， 因它们在结构上具有一定的同源性， 故可相互 结合形成二聚体。 当Bcl-2过度表达时， 可抑制Fas介导的细胞 凋亡， 形成Bcl-2同源二聚体； 而当Bax过度表达时， 不仅可以 与Bcl-2形成异源二聚体， 从而拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用 [25] ， 而且还可形成Bax同源二聚体， 促进细胞色素C释放 [26] 。 因此， Bcl-2与Bax的比值可以反映Bcl-2和Bax在细胞凋亡过程中的关 系： Bcl-2/Bax比值升高， 则抑制细胞凋亡， 反之， 则促进细胞 凋亡 [27] 。
4.2 龟鹿二仙胶及其拆方对软骨细胞凋亡基因表达的 影响 李楠等 [28] 发现： 龟鹿二仙胶可以非常显著的抑制SD大鼠 软骨细胞Bax、 Caspase-3、 p53的表达， 显著促进Bcl-2的表达， 从而发挥抑制凋亡作用， 但效果不如盐酸氨基葡萄糖。 卢思俭等 [29] 发现在兔实验性骨关节炎中， 软骨细胞Bcl-2、 Bax在转录和蛋白水平均增高， 但Bax增高明显， Bcl-2/Bax比值 下降， 由此认为Bax的增高是引起骨关节炎的主要原因。 细胞 染色法显示Bcl-2基因在细胞胞浆中为棕黄色片状或颗粒状阳 性染色， Bax基因在细胞核、 胞浆中为棕黄色片状或颗粒状阳 性染色， 而染色的深浅及分布面积密度可以大致判断出软骨细 胞抵抗凋亡的能力， 以及组方与拆方药效的差别。 有实验染色 结果显示龟鹿二仙胶组对Bcl-2表达的光密度值、 阳性面积数 较拆方组强， 其阳性染色亦比拆方各组深； 对Bax表达的光密 度值、 阳性面积数较拆方组弱， 其阳性染色亦比拆方各组浅。 Bcl-2表达量上升， Bax表达量下降， Bcl-2/Bax比值越大， 可表 明软骨细胞对凋亡的抵抗作用越强， 是干预药物起药效作用的 表现， 从而提示龟鹿二仙胶及其拆方含药血清能在基因水平对 硝普钠 （Sodium Nitroprusside， SNP）诱导后的软骨细胞Bcl-2与 Bax的表达具有良好调控作用， 可有效地阻断NO介导的软骨细 胞凋亡， 从而达到延缓骨关节炎发病过程的作用。
结语
龟鹿二仙胶主要提取物甾体类生物激素、 多糖类和脂肪酸 类物质能够不同程度地促进豚鼠关节软骨细胞中以上4项的表 达， 其中该方醇提取部位最有可能是发挥药效的有效部位。 在促进软骨细胞Ⅱ型胶原以及蛋白黏多糖的合成方面， 全 方药效显著优于各拆方； 鹿角胶促表达能力不优于龟板胶； 两 君药促表达药效显著优于人参和枸杞； 而人参和枸杞无明显促 软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白黏多糖的作用。
在抑制由硝普钠诱导的软骨细胞凋亡方面， 全方含药血 清药效优于拆方， 其能在基因水平对硝普钠诱导后的软骨细胞Bcl-2与Bax基因的表达具有良好的调控作用， 该作用主要体现 在凋亡早期通过上调Bcl-2以及下调Bax基因的表达量来实现， 该作用可能与其对抗经NO抑制的软骨细胞内的线粒体及柠檬 酸循环有关的酶有关， 具体作用机制仍需进一步的研究。 综上所述， 龟鹿二仙胶具有明显的软骨细胞促增殖和软骨 细胞凋亡抑制作用， 从而延缓关节软骨的退变， 这可能是其治 疗骨关节炎的机制之一。 龟甲胶和鹿角胶是龟鹿二仙胶发挥药 理学效应的主要物质。 故有研究 [30] 选用龟甲胶和鹿角胶为实验 干预药物， 发现龟甲胶和鹿角胶均可显著上调3月龄豚鼠骨关节 炎软骨细胞MEK1/2和ERK1/2的基因表达， 并可增加MEK1/2、 ERK1/2的蛋白表达， 从而对豚鼠骨关节炎软骨细胞有促增殖作 用。 由此可以看出， 研究龟甲胶和鹿角胶防治骨关节炎的作用机 制， 成为今后龟鹿二仙胶实验研究的重点， 并将为这两味君药 延缓骨关节炎发病和病理进程提供新依据。
来源：中华中医药杂志 作者：林嘉辉 陈炳艺 李楠
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